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章台柳
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多层菊形团样胚胎性肿瘤（embryonaltumorswithmultilayeredrosettes，ETMRs）是一种在幼儿特发的恶性脑瘤，预后普遍较差。其呈现出多种组织学类型，室管膜母细胞瘤（EBL）、髓母细胞瘤（MEPL）和具有丰富神经毡和真菊形团样的胚胎性肿瘤（ETANTR）等，共同形成一种独特的生物学肿瘤类型，即ETMR。ETMRs的遗传学特征为19号染色体上miRNA簇（C19MC）的扩增并与TTYH1融合，在90%的ETMR中存在。目前没有有效的治疗方法，需要更多地了解ETMR的肿瘤发生病理过程，以制定新的治疗策略。
近日，来自德国的StefanM.Pfister、MarcelKool和AndreyKorshunov合作在Nature杂志上发表文章ThemolecularlandscapeofETMRatdiagnosisandrelapse，报道了ETMR肿瘤原位和复发的分子图谱。ETMRs主要分为C19MC扩增型和非扩增型，非扩增型中具有DICER1种系变异或其他miRNA相关如miR-17-92的体细胞变异。ETMRs肿瘤中SNVs的保守度较低，但R-loops结构导致的基因组不稳定则普遍存在，而DICER1功能的缺失导致R-loops增加。原位和复发肿瘤相比，SVs变异具有保守性，而SNVs变异不具有。拓扑异构酶抑制剂和PARP抑制剂联用靶向R-loops，或是治疗ETMRs的有效策略。
研究人员首先对份ETMR样本的DNA甲基化图谱及28份mRNA-seq数据进行聚类分析，验证了ETMRs是与其他脑部肿瘤完全不同的肿瘤类型。没有C19MC扩增的ETMRs倾向于聚类在一起，但并不与C19MC扩增的ETMRs分开；ETMRs的miRNA表达具有独特的模式，C19MC扩增型和非扩增型具有相似性。C19MC非扩增型ETMRs中仍然有C19MCmiRNAs表达，其水平比扩增性低10倍，C19MCmiRNAs在正常的脑组织或其他脑肿瘤中不表达。ETMRs中特异性上调的成熟miRNA包括所有C19MCmiRNA和miR-17-92簇，而let-7miRNA家族的几个成员在ETMRs中特异性下调。ETMRs可在全部的脑区发生，没有组织学特异性。因此，ETMRs具有独特的分子图谱的肿瘤类型，虽然其组织病理学特征具有多样性，具有C19MC扩增型和非扩增型，解剖位置多样，但是肿瘤间的分子间异质性有限。相比于正常脑组织和其他脑瘤，ETMR上调Hippo、WNT、Notch、SHH等发育相关的信号通路和碱基切除修复、P53等DNA修复途径。但一些ETMR中缺乏这些通路的上调，这可能与肿瘤内部异质性相关。DNA修复基因的表达和组织学上的差异可能与后代的分化水平有关，而DNA修复表达水平高的未分化细胞在复发是生长出来。除了C19MC扩增，ETMRs是否具有其他的DNA变异？研究人员对82个肿瘤样本进行测序，其中包括16例C19MC非扩增型和12例复发肿瘤，发现原发肿瘤中DICER1、CTNNB1、TP53具有频发突变，其他发育相关的突变则频率很低。值得注意的是，所有DICER1突变都发生在C19MC非扩增型，而且具有体细胞突变和种系突变。DICER1突变导致3’/5’成熟miRNA的比率显著增加。其他的DNA变异包括13号染色体上miR-17-92簇的扩增、影响C19MC位点的断点（breakpoints）突变及严重的染色体不稳定性。ETMRs中普遍突变的基因不多，但拷贝数变异较为常见，而且很多染色体碎裂（chromothripsis）导致的断点突变大多位于C19MC周围，这导致ETMR基因组具有结构上的不稳定性。分析原位肿瘤和复发肿瘤的全基因组测序数据，发现获得体细胞SNV突变不是肿瘤发生的早期驱动事件。相比于原位肿瘤，复发肿瘤的体细胞SNVs突变大幅增加，表明肿瘤治疗诱导产生新的突变。同时，原位肿瘤的突变特征主要与年龄有关，而复发肿瘤呈现出新型的突变特征。原位肿瘤的体细胞SNVs突变没有偏好性，而复发肿瘤显示出CA、CT、TA的突变而且具有转录链偏好性；SNVs的组成在治疗后发生改变，但多次复发肿瘤的SNVs具有相似性。虽然SNV突变不具有保守型，但是原位肿瘤和复发肿瘤中断点突变（breakpoints）的保守型很强。两者间73%的断点突变显示出保守性。同一个体的原位和复发肿瘤样本中，仅有个原位肿瘤断点突变在复发肿瘤中检测不到，说明结构变异（structuralvatiants，SVs）的形成是ETMR肿瘤发生的早期事件。那么，什么导致ETMR中断点突变的产生？R-loops是RNA聚合酶暂停时形成的结构，能导致非模版链DNA环移动，造成DNA损伤。R-loops可以在解旋酶活性被破坏后形成，促进转录和复制的碰撞，导致染色体的不稳定。ETMRs中DNA/RNA解旋酶的表达和解旋酶活性有关的过程被上调，提示R-loops可能在断点突变的形成中起作用。ETMRs中R-loops主要位于转录起始位点、CpG岛等；19号染色体上具有高密度的R-loops，但仅在ETMRs中C19MC周围有一个较大的峰值。同时，很多断点与R-loops具有重叠，且断点的形成与R-loops富集的区域具有强相关性；对比位于R-loops内、外的断点数量，发现R-loops中的断点具有富集性，而且断点在R-loops中富集特异性地发生在ETMR中。R-loops可能在ETMRs的断点突变产生中有重要作用。大多数ETMRs中存在miRNA相关的变异，而DICER1等多种miRNA处理因子与R-loops的形成相关。Dicer1敲除细胞导致R-loops和双链断裂增加，表明在ETMRs中，R-loops可能导致染色体不稳定性，而miRNA处理缺陷导致R-loops增加。最后，研究人员探究R-loops是否可以作为治疗靶点。该研究团队之前报道过ETMRs对拓扑异构酶I（TOP1）的抑制剂高度敏感，TOP1可以调控R-loops的形成。而topotecan和irinotecan通过将TOP1与DNA共价连接而起到TOP1*素的作用；PARP1能够通过parylation修饰释放TOP1。研究人员使用PARP和TOP1抑制剂的联用提高R-loops的水平，发现两者具有协同作用，降低ETMRs细胞的生存，且这种协同作用更依赖于TOP1抑制剂。TOP1抑制剂增加细胞核中R-loops的数量，而PARP抑制剂不能；但两者联用大幅增加R-loops并导致DNA损伤，R-loops的增加导致DNA损伤。因此，PARP和TOP1抑制剂在ETMRs中具有协同作用，两者联用或可成为ETMR患者的治疗方案。总的来说，本研究充分描绘了ETMRs肿瘤的原位和复发的分子图谱，并揭示出R-loops的上调导致基因结构变异，造成基因组不稳定性，同时证明靶向R-loops或将是治疗ETMRs的有效策略，为我们理解ETMRs肿瘤的病理过程及治疗方法提供了新的视角。原文链接：